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Connaître avec davantage de précision l’exposition de la population générale aux pesticides en mélange et mieux caractériser les dangers que cette exposition pourrait engendrer, figurent au centre des préoccupations de plusieurs équipes de TOXALIM, en particulier les équipes E2-MeX, E3-PEP, E6-TMR et E10-TCMX, ainsi que la plateforme AXIOM-METATOUL.

Grâce à plusieurs projets multidisciplinaires soutenus par la Région Midi-Pyrénées, par l’ANR ou par l’ANSES, à un réseau collaboratif très dense, à plusieurs thèses mobilisées sur cette problématique et au développement d’outils performants et innovants, des avancées significatives ont pu être obtenues au cours des deux dernières années.

1. Pouvoir définir de manière qualitative et quantitative quels sont les mélanges de substances ("cocktails") auxquels nous sommes exposés est un sujet de recherche à part entière. Un des objectifs du projet PERICLES (Exposition à des mélanges de substances actives et possibles effets combinés sur des cellules humaines) soutenu par l’ANR et coordonné par l’ANSES, auquel deux équipes de TOXALIM ont contribué (E2 et E10), a été d’identifier les cocktails de pesticides auxquels les consommateurs ont le plus de chance d’être exposés. Ce calcul repose habituellement sur le croisement des données de consommation alimentaire avec celles concernant la contamination des aliments.

• • L’originalité du programme PERICLES a été d’aborder la problématique des cocktails en partant de l’exposition réelle de la population française afin d’appréhender la nature des effets cocktailsin vitrosur des cellules d’origine humaine. Une méthode statistique de classification a été développée et appliquée à ces expositions afin de déterminer les principaux cocktails et les principaux aliments vecteurs. Sept cocktails contenant de 2 à 6 pesticides ont ainsi été identifiés et une batterie de tests toxicologiquesin vitro, évaluant la viabilité cellulaire, la génotoxicité, l’activation de récepteurs xéno-hormonaux et d’autres biomarqueurs ont été réalisés sur des cellules représentatives de différents organes humains (foie, rein, intestin, cerveau, côlon). Les résultats ont permis de concentrer la suite des études sur 3 cocktails présentant les effets les plus significatifs. Les effets toxicologiques des différents mélanges ont été comparés aux modèles d’additivité des doses et d’additivité des réponses afin de déterminer s’il est possible de prévoir l’effet d’un cocktail sur la base des connaissances des effets toxicologiques des pesticides seuls (Crépet et al., 2013). L’étude des effets des 7 cocktails sélectionnés dans l’étude PERICLES a permis de mettre en évidence des effets cytotoxiques plus ou moins importants selon les cocktails et les lignées cellulaires. Un cocktail s’est révélé génotoxique sur une lignée hépatique (HepG2), avec un effet plus important que celui résultant de la somme des effets des constituants du mélange (Graillot et al., 2012a). D’autres modes d’action, tel que la transactivation du récepteur PXR dans les cellules de foie, ont montré des effets infra-additifs des mélanges testés (Rouimi et al., 2012). Les résultats mettent en évidence une grande variabilité de la sensibilité des modèles cellulaires et des tests réalisés.  Ainsi, ces cocktails produisent des effets additifs mais aussi des effets supra ou infra-additifs, ce qui rend difficile la prédiction de la réponse des cocktails à partir des résultats des réponses et des doses des pesticides seuls.

2. Mesurer la concentration en contaminants dans des échantillons de sang ou d’urine prélevés dans la population représente un autre moyen d’estimer l’exposition de cette dernière aux substances chimiques. Bien que cette méthode présente des limites (mis à part le cas des polluants persistants et bioaccumulables, les substances détectées ne sont représentatives que d’une exposition récente ; par ailleurs, les résidus présents dans le sang ou l’urine sont le plus souvent des métabolites que l’on ne connait pas toujours), elle a le mérite de pouvoir être menée à l’échelle de l’individu.

• • Suite à la mise en place d’une collaboration avec l’INSERM, TOXALIM a entrepris de caractériser l’exposition aux pesticides d’individus recrutés dans le cadre de la cohorte PELAGIE (Perturbateurs Endocriniens Etude Longitudinale sur les Anomalies de la Grossesse, l'Infertilité et l'Enfance). La constitution de cette cohorte de près de 3500  femmes enceintes de la région Bretagne a eu pour but d’évaluer les conséquences des expositions à divers contaminants, en particulier les pesticides, sur le déroulement de la grossesse, son issue et sur le développement psychomoteur de l’enfant. A partir d’un nombre restreint d’échantillons d’urines provenant de ces femmes enceintes il a été possible de déterminer le spectre de contamination de ces individus. Dans un premier temps une liste de 47 pesticides a été élaborée à partir des données de pratiques agricoles correspondant aux lieux d’habitation des femmes au moment du recueil urinaire, d’une part, et des recommandations d’usage des produits phytosanitaires des chambres d’agriculture et de l’index phytosanitaire publié par l’ACTA, d’autre part. Dans un second temps, les métabolites correspondant à la liste de pesticides choisis ont été recherchés dans les données produites à partir de l’analyse des échantillons urinaires (378 métabolites). La démarche repose sur l’identification de signaux spécifiques à un pesticide ou ses produits de transformation (métabolites) sur la base de sa masse exacte, et sur une confirmation des structures chimiques par comparaison avec des standards, lorsqu’ils existent, ou des produits de biotransformation isolés à partir d’expérimentations animales complémentaires. Le signal d’une substance détectée par spectrométrie de masse étant proportionnel à sa concentration, la méthode globale est qualifiée de semi-quantitative. Elle discrimine des groupes d’exposition en fonction de la surface consacrée à la culture céréalière à proximité du lieu de résidence des individus. Les données obtenues indiquent que ce sont majoritairement les métabolites de deux pesticides, l’azoxystrobine et le fenpropimorphe, qui permettent de discriminer ces groupes d’exposition. Ce travail mené par la plateforme AXIOM-METATOUL de l’Unité TOXALIM sur les échantillons d’urine des femmes enceintes a nécessité un développement méthodologique important pour déterminer, à partir de l’analyse des métabolites urinaires, le spectre d’exposition de ces femmes aux pesticides. Il a nécessité la mise en œuvre de méthodes séparatives et spectrométriques de dernière génération (chromatographie liquide ultra haute performance associée à la spectrométrie de masse haute résolution), mais également une connaissance très fine du métabolisme des pesticides (Jamin et al., 2013).

3. Outre l’étude de la présence de résidus de pesticides dans les fluides biologiques humains, une des approches possibles pour prendre en compte ces expositions multiples est d’étudier les modifications biologiques dans l’organisme exposé, afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’exposition à des polluants.

• • Ces modifications peuvent être identifiées grâce à une analyse globale des métabolites endogènes dans des fluides biologiques (empreinte métabolique). Ces métabolites sont des petites molécules, issues du fonctionnement d’un organisme tel que par exemple des acides aminés, des acides organiques de petite taille (acide citrique, hippurique), ou encore des sucres, ou des acides gras simples. Sur des échantillons d’urine provenant de la même cohorte, il a donc été procédé à une analyse métabolomique afin d’appréhender l’incidence d’une exposition à un mélange complexe de pesticides sur le métabolome (ensemble des métabolites présents dans l’échantillon). Les analyses ont été effectuées en RMN et les données ont été traitées par régression des moindres carrés partiels (PLS-DA). Les groupes d’exposition préalablement constitués à partir des cultures céréalières ont pu être discriminés par cette approche. Cette discrimination repose principalement sur des métabolites tels que la glycine, la thréonine, la glycérophosphocholine, ou encore les acides lactique et citrique. Ces résultats suggèrent que l’exposition à des mélanges complexes de pesticides à faibles doses est susceptible d’avoir un impact sur les voies métaboliques de l’organisme en affectant le métabolisme énergétique et le stress oxydant (Bonvallot et al., 2013). Cette étude métabolomique est la première du genre à étudier l’impact d’une exposition aux pesticides et à avoir été menée chez l’Homme.

4. Les approches métabolomiques ont également été développées à partir d’approches expérimentales dans le cadre des programmes EXPOMATPEST (Impact d’une exposition maternelle à un mélange de pesticides sur l’immunité, l’hématopoïèse et le système nerveux central de la descendance) et EPICEE (Exposition aux pesticides individuels ou en combinaison : évaluation de biomarqueurs), soutenus respectivement par l’ANR et par l’ANSES et coordonnés par L. Payrastre (E6).

• • Dans ce cas, trois pesticides (chlorpyrifos, atrazine et endosulfan) seuls ou en mélange ont été incorporés à faible dose (correspondant à la DJA) à de l’aliment distribué à des souris depuis l’accouplement jusqu’au sevrage des souriceaux. Ces derniers ont été ensuite nourris avec l’aliment reçu par leur mère pendant une période additionnelle de 11 semaines. Une comparaison des effets du mélange avec ceux observés à partir chacune des substances a été réalisée, non seulement sur le métabolome, mais également sur l’hématopoïèse, l’immunité, la fonction hépatique ou le système nerveux central. L’analyse métabolomique des plasmas d’adultes a mis en évidence des différences entre mâles et femelles. Indépendamment du sexe, l’empreinte métabolique obtenue suite à l’exposition alimentaire aux pesticides en mélange est différente de celle observée chez les animaux consommant l’aliment contaminé par chacun des pesticides, ces derniers étant eux-mêmes différents de ceux non exposés aux pesticides. Les perturbations métaboliques entre les différents groupes animaux sont perceptibles dès le sevrage (Demur et al., 2013). La métabolomique est non seulement adaptée à l’étude des fluides biologiques tels que l’urine ou le plasma, mais peut également être envisagée sur des extraits tissulaires. Des extraits de foie ont pu être analysés en RMN à partir de souris exposées in utero et via l’aliment à de l’endosulfan à faibles doses, confirmant que des perturbations métaboliques mises en évidence à partir du plasma pouvaient être associées à un stress oxidant et  à une atteinte du métabolisme du glucose observés au niveau hépatique (Canlet et al. 2013). Par ailleurs ces travaux, réalisés en collaboration avec une équipe INSERM du CHU Purpan, montrent qu’à des doses auxquelles ils sont supposés ne pas exercer d’effet néfaste sur la santé l’atrazine, le chlorpyrifos, l’endosulfan, considérés individuellement, sont capables de perturber l’hématopoïèse, l’immunité ainsi que l’expression de certains gènes hépatiques liés au stress et à la toxicité cellulaire. Ces effets ont été observés après une exposition pré- et postnatale mais certains effets ont été observés sur les souriceaux dès le sevrage. Au niveau hématopoïétique le mélange n’exerce pas d’effet supérieur à celui des pesticides seuls. En revanche, sur la plasticité synaptique à court terme, il exerce un effet supérieur à celui des pesticides individuellement considérés chez certains animaux de 14 semaines. Au niveau hépatique, le mélange reproduit globalement les modulations induites par les pesticides seuls en ce qui concerne l’expression des gènes de stress et de toxicité. De façon générale, l’impact du mélange peut difficilement être prédit à partir de l’impact des pesticides seuls puisque selon le paramètre étudié le mélange peut ou non exercer un effet supérieur ou égal à celui des  pesticides pris individuellement (Demur et al., 2013). Les essais menés in vitro sur le même mélange à partir d’hépatocytes murins ou humains en culture primaire indiquent que les effets observés sur le mélange s’expliquent essentiellement par les effets du pesticide le plus actif (endosulfan ou chlorpyrifos selon les tests) (Rouimi et al., 2012). 

5. Parallèlement aux études de métabolomique, plusieurs travaux récemment menés à TOXALIM ont eu pour objectif d’approfondir le mécanisme d’action toxique de pesticides à faible dose.

• • Parmi ces derniers, une série d’études a concerné le Fipronil, substance active utilisée comme insecticide et comme traitement antiparasitaire externe chez le chien et le chat. Ces études menées chez le rat ont permis de montrer que la transformation du fipronil en fipronil-sulfone, sous l’action des cytochromes P450 hépatiques, pourrait jouer un rôle majeur dans la capacité de cet insecticide à perturber la fonction thyroïdienne (Roques et al., 2012). Deux récepteurs nucléaires : CAR et PXR, ont été identifiés comme des cibles du fipronil dans le foie. Ils agissent comme des régulateurs majeurs des voies moléculaires impliquées d'une part dans le métabolisme du fipronil en fipronil sulfone, et d'autre part dans le métabolisme et le transport des hormones thyroïdiennes (Roques et al., 2013). L’étude de la distribution tissulaire de ce produit réalisée chez le rat à partir de Fipronil radiomarqué indique que c’est bien la forme sulfone (active) que l’on retrouve en majorité dans des tissus tels que le tissu adipeux, les surrénales, le foie, le rein, les testicules ou encore le cerveau, 72 heures après l’administration par voie orale de fipronil, alors que ce dernier a disparu (Cravedi et al., sous presse). L’équipe animée par Roger Rahmani a obtenu plusieurs résultats marquants sur les pesticides organochlorés à partir de travaux menés sur des hépatocytes humains en culture primaire ou sur des lignées cellulaires provenant d’hépatocarcinomes humains (lignée HepG2). Elle a ainsi mis en évidence des modifications profondes du phénotype des hépatocytes lorsque ces derniers étaient traités par des pesticides tels que le DDT, l’heptachlore ou l’endosulfan, entrainant une dédifférenciation cellulaire et une induction de la transition épithélio-mésenchymateuse, des phénomènes connus pour être en lien avec le développement tumoral (Zucchini-Pascal et al., 2012). Elle a également montré que l’endosulfan pouvait perturber les mécanismes d’adhésion et de migration cellulaire (Peyre et al., 2012).

6. Après avoir développé un test à haut débit de génotoxicité in vitro basé sur la phosphorylation de l’histone H2AX qui reflète les cassures double brin de l’ADN, l’équipe E2 l’a appliqué aux mélanges de pesticides identifiés dans le cadre du projet PERICLES.

• • Plusieurs lignées cellulaires ont été utilisées pour ce criblage, mais seule la lignée HepG2 a donné des résultats positifs pour un des 7 mélanges testés, constitué de procymidone, iprodione, cyprodinil, fludioxonil et l-cyhalothrine (voir ci-dessus, Graillot et al., 2012a). Ce test a également été utilisé pour mettre en évidence l’effet génotoxique d’une famille de pesticides : les méthyl-pyrrazoles (Graillot et al., 2012b).

La richesse de cette production scientifique place TOXALIM au tout premier rang des laboratoires européens travaillant sur le risque lié aux résidus de pesticides.

• Deux chercheurs de l’Unité (L. Payrastre et R. Rahmani) ont pris part à l’expertise collective INSERM,  "Pesticides : effets sur la santé" 
• En utilisant des approches non conventionnelles (hors des lignes directrices de la toxicologie réglementaire) les équipes de cette unité ont pu décortiquer certains mécanismes d’action aux niveaux cellulaire et moléculaire et de ce fait participer à l’élaboration du corpus de connaissances indispensable à une meilleure évaluation du risque associé à l’exposition aux pesticides à faible dose.
• Plusieurs travaux ont pour objectif d’apporter des éléments de réponse à la difficile problématique des mélanges qui nécessite la mise en œuvre d’approches nouvelles adaptées au haut débit.  
• L’ensemble des résultats de métabolomique montre que des approches globales, non ciblées, peuvent permettre non seulement de qualifier une exposition à des mélanges complexes de pesticides à faible dose, mais également de discriminer des populations en fonction du niveau d’exposition. Les modifications subtiles du métabolisme, si elles ne peuvent être considérées,a priori, comme des effets néfastes, indiquent néanmoins que des voies métaboliques peuvent être modifiées par une exposition à des pesticides à des doses présentes dans l’environnement et/ou l’alimentation. L’interprétation de ces données reste un champ d’investigation encore peu couvert par la toxicologie.